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水中微生物的计测

浏览次数:814次发表时间:2017-07-20

1.前言

河川、湖沼、地下水等天然水中生息着许多微生物,以天然水为取水源的工厂用水,微生物很容易在水槽内或配管内增殖。为杀死工厂用水中的微生物,使达到无菌化,不管是添加氯或进行紫外线照射,时常会发生因杀菌不良而反而使微生物增殖的困扰。

纯水或超纯水是半导体产业、医疗药品产业及原子能产业中所使用的工程水,尤其是半导体产业所用的超纯水,水质要求极低的不纯物浓度。微生物和其他的不纯物不同,即使在超纯水系统中去除,也会在系统及供给配管内再增殖,因此如何控制微生物的浓度便成为重要的课题。微生物细胞内含有P或Na等微量元素,会对半导体的产品产生不良影向。举例来说,R.A.Cravan曾报告,只要有一个细菌附着在晶圆的表面,几型的磷浓度便增加到 10-l2atmos/cm2。对於正进入高集积化的半导体产业,此种微量的不纯物的混入已成深刻的问题。

因此,除了提昇杀菌技术外,还需有严密的浓度管理,微生物的计测成了一个非常重要的技术。

2.水中细菌的计测方法

因目的不同,而有许多方法。现将一般常用的水中细菌数的计测方法先容於後。

(1) 平板培养法 (JlSK0101、土水试验法等)

和溶解有试验水的寒天培基混会一起,或於涂抹在固化的平板寒天培基後,用一定的条件进行培养的方法。是常用的方法,每一片平板的试验水接种量约1ml,检测界限约1个/ml左右。培基只培养选择的微生物,所以只要改变培基的种类,便可计测不同种类的微生物。

(2) 直接观察法 (土水试验法等)

用吖啶染料等将细菌的DNA(去氧核酸)或 RNA(核醣酸)染色,然後在落射萤光显微镜下直接观察计测发着萤光的细菌。由於此一方式并不做细菌培养,故可迅速地进行计测。

(3) 准确数(MPN)法 (土水试验法等)

阶段性的改变试验水的接种材料,分数根进行试验,由各稀释阶段的阳性管列,以推计学的手法推定试料中的细菌数,属定量方法。後用确数表示上水等大肠菌群的数量。

(4) 滤膜法 (JlSK0550、土水试验法等)

适量的试验水在灭菌过的滤膜(通常孔径是 0.45um)上进行过滤,然後捕捉细菌。是一种将浸过液体培基的衬垫(Pad)或寒天平板培基与过滤面向上的滤膜密着,进行细菌培养的方法。此法可以使用大量的试验水,亦可检测出微量的细菌。为JIS K0550(超纯水中的细菌数试验方法)所采用,根据培养时间而有短时间法与长时间法之分。

3.半导体用超纯水中的细菌

(1) 细菌的特徵

超纯水中对於细菌增殖所需的有机物或盐类含量极少,因此细菌种类可受限制。细菌由营养的要求性,可分为,(1)可自行合成有机代谢生产物(营养源)的自力营养细菌,(2)需要部分补给的外力营养细菌,及(3)完全无合成能力,而需依赖外部的无力营养细菌。根据调查,超纯水中存在的细菌大多是外力营养细菌,是属需要营养源的细菌。生息在超纯水中的细菌检测出有,Pseudomonas属 Flavobacterium属,Alcaligenes属及Achromobacter属。其中,检测出Pseudomonas属的细菌频度极高,占80~90。又,根据糖类资化试验的结果,酷似Pseudomonas cepacia。

图1 细菌增殖对TOC依存性的检讨结果

表1 超纯水中的细菌培养试验结果

试料名

好氧性细菌类(个/l)

压氧性细菌类(个/l)

超纯水装置A

3~7

N.D

超纯水装置B

5~13

N.D

超纯水装置C

16~30

N.D

(2) 在超纯水中的活动

细菌根据对氧的需要,分类为好氧性细菌和厌氧性细菌。由动作中的超纯水系统中采取样品,针对好氧与厌氧进行培养的结果如表1所示。无论何种系统,均无法检测出厌氧性细菌,生息於超纯水中的细菌是受好氧性细菌所支配。又,检测出的细菌,其进行微生物学的性状试验及糖类资化试验的结果,如表2所示。由这些结果,发现检测出来的细菌类似Pseudomonas pickettii。

接着针对确认存在於超纯水中的P.cepacia及 P.pickettii,检讨其在超纯水中的增殖特性。结果有关超纯水中TOC(全有机体碳)浓度依存性的检讨结果如图1所示。TOC为3ug/l,细菌增殖所需的有机物即使在极低的条件下,亦有增殖。这里,细菌的形状是lum?X2um(含有水分量90),构成成分如表3所示。每一个细菌的碳质料是7.9X l0-14g,所以若将超纯水中的TOClug/l全部换成菌体,则细菌浓度变成1.0Xl04个/ml。结果显示,由超纯水中极微量的营养源亦有可能增殖细菌。

对超纯水中溶存氧浓度依存性的检讨结果如图2所示。P.cepacia属於绝对好氧性菌,当溶存氧浓度在5ug/l以下便会减少。另一方面,P.pickettii即使在5ug/l以下的溶存氧浓度条件下,培养8天以後,也会有些微的增殖情况。由此结果可认定P.picketti具有接近通性厌氧性菌的性质。

由以上结果可知,即使没有溶存氧浓度存在的极高纯度的超纯水中,亦有可能发生细菌增殖。

表2 细菌的固定试验结果

项目

培基

反应/酵素

试验结果

N03

硝酸钾

硝酸盐还元至亚硝酸

+

硝酸盐还元至氮气

-

TRP

色胺酸

色胺酸生成性

-

ADH

海藻

海藻胼

-

GLU

葡萄糖

酸性化

-

URE

尿素

脲酶

-

ESC

马栗树板苷

加水分解 / β配糖晦

+

GEL

加水分解 / 蛋白晦

-

PNPG

P-硝基酚

β-D-半乳糖

β-牛乳糖

-

资化特性

GLU

葡萄糖

同化

+

ARA

树胶糖

同化

+

MNE

甘露糖酶

同化

-

MAN

甘露醇

同化

-

NAG

乙醯基

同化

-

MAL

麦牙糖

同化

-

GNT

葡萄糖酸盐

同化

+

CAP

癸酸盐

同化

-

ADI

酸盐

同化

+

MLT

苹果酸盐

同化

-

CIP

枸橼酸盐

同化

-

PAC

苯乙胺

同化

-

OX

环丁烷-P-菲基

二氯氧化酶

+

图2 细菌增殖对溶存氧依存性的检讨结果

图3 过滤器对细菌捕捉性能的检讨结果

图4 过滤水量和细菌数测定值

表3 细菌的构成元素

元素名

构成比率 (%)

质量 (g)

C

50

7.9 X 10-14

O

20

3.1 X 10-14

N

14

2.2 X 10-14

H

89

1.3 X 10-14

P

3

4.7 X 10-15

S

1

1.6 X 10-15

K

1

1.6 X 10-15

Na

1

1.6 X 10-15

Ca

0.5

1.6 X 10-16

其他

1.5

-

演算条件:细菌形状1um?X2um

4.极低浓度细菌数的计测方法

(1) 滤膜的孔径

滤膜法中用以捕捉细菌的滤网的孔径,一般是 0.45um。但是,和Pseudomonas dominuta一样,也有能够通过0.2um滤网的细菌,尤其是像超纯水这种以极微量细菌数为计测对象的场所,过滤器的Leak是一大问题。反之,如果是选择微细孔径的过滤器,则每单位时间的过滤量会减少,这对於需要过滤大量的试验水才能计测极微量的细菌相当不利。

图3是使用实际的超纯水系统,依序使用1.0u m、0.45um、0.2um的过滤器过滤超纯水,然後再针对各过滤器的细菌捕捉性能进行检讨的结果。将过滤器所捕捉的细菌,转移至M-TGE的寒天培基中,以25℃的温度培养5天。则由1.0um及0.45 um的过滤器中会检测出许多细菌,但由0.2um的过滤器则检测不出来,证明0.45um的过滤器会发生细菌泄漏。由此结果来看,确认超纯水中生息的细菌至少有0.45um以上.使用目前的过滤器即能发挥细菌捕捉性能。

(2) 过滤水量和计测值的信赖性

根据JISK0550(超纯水中的细菌数试验方法)决定采样的水量,使过滤器上捕捉的细菌数(菌落)有20~300个。亦即,为精密地测得细菌数,除应防止测定时的污染外,过滤水量也是左右计测值的信赖性的一个重要项目。今针对超纯水系统中,细菌存在较多的场所与只有极微量的试验水,讨论其过滤水量与计测值。

图4(a)为细菌数多时的计测值,(b)为极微量细菌数的计测值。各采样水量收集20~30次的计测值。以此采样水量的计测值为基础,算出95的信赖区间(X±1.966),并入图中。

由图4可知,若过滤水量愈多,细菌数的计测值差异愈小。当超纯水中的细菌数高约20个/l时, 5l以上的过滤水量即可获得10~25个/l (标准偏差 6:3.18)较高精度的计测值。另一方面,细菌数在 5个/l以下时,即使过滤水量有10l,计测值也只有1~8个/l (标准偏差6:1.14),计测值的变动范围变大。这是因为在计测极低浓度细菌数时,污染的影响十分明显,为提高计测值的精度,应加大过滤器的面积,以增加过滤水量。



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